BIOQUÍMICA

Experimento 5

Electroforesis de proteínas del suero humano
en gel de poliacrilamida bajo condiciones
desnaturalizantes (sds-page)

Objetivos

conocer la importancia de la electroforesis
Aprender en la preparación del gel

INTRODUCCIÓN

Electroforesis

Electroforesis es la migración de moléculas cargadas en solución como respuesta a la presencia de un campo eléctrico. La velocidad de migración depende principalmente de la fuerza del campo, de la carga, forma, masa y tamaño de la molécula, así como de la fuerza iónica, viscosidad y temperatura del medio en el que las moléculas se estén moviendo. Como herramienta analítica, la electroforesis es rápida, sensible y simple. La electroforesis es ampliamente usada para estudiar propiedades de especies cargadas en solución, y como una técnica de separación.

Matrices de soporte

Generalmente la muestra es corrida en matrices como papel, acetato de celulosa, geles de almidón, agarosa ó poliacrilamida. La matriz inhibe la difusión osmótica, así como el mezclado producido por convección térmica., además proveee un registro del proceso electroforético ya que puede marcarse y usarse para mediciones, autoradiografía ó almacenamiento. Las matrices de soporte más ampliamente usadas (agarosa y poliacrilamida) proveen además, un medio para separar moléculas por tamaño, ya que son geles porosos y pueden actuar como tamices moleculares.

Separación de proteínas

Las proteínas son compuestos anfotéricos, por lo tanto su carga neta está determinada por el pH del medio en el que están suspendidas. En una solución con un pH por encima de su punto isoeléctrico, una proteína tiene una carga neta negativa y en un campo eléctrico migra hacia el ánodo, mientras que migrará hacia el cátodo a pHs por debajo de su punto isoeléctrico..

Separación de proteínas bajo condiciones desnaturalizantes

El dodecil sulfato de sodio (SDS) es un detergente aniónico que desnaturaliza proteínas “envolviendo” el esqueleto polipeptídico, la unión presenta una relación de masas 1,4:1. El SDS confiere carga negativa al polipéptido en relación a su longitud. Usualmente es necesario reducir los puentes disulfuro de las proteínas para permitir la unión cuantitativa del SDS, esto se lleva a cabo en caliente con 2-mercaptoetanol. En SDS-PAGE, la migración no es determinada por la carga eléctrica del polipéptido, sino por su peso molecular.

Sistemas de amortiguador continuos y discontinuos

Un sistema continuo tiene un gel de separación sencillo y usa el mismo amortiguador en los tanques y en el gel, en un sistema discontinuo, un gel de poro grande y no restrictivo, llamado gel de apiñamiento, es colocado en la parte superior del gel de separación, llamado gel de resolución. Cada gel está hecho con un amortiguador diferente, y el amortiguador de los tanques es diferente al de los geles.

Geles de poliacrilamida

Los geles de poliacrilamida se obtiene polimerizando monómeros de acrilamida (CH₂=CHCONH₂) en cadenas largas y entrecruzándolas con un compuesto bifuncional como N,N’-metilenbisacrilamida ( CH₂(NHCOCH=CH₂)₂, usualmente llamada bisacrilamida). La polimerización es iniciada mediante la adición de persulfato de amonio ó riboflavina, y se usa N,N,N’,N’-tetrametilenetilendiamina (TEMED) como acelerador del proceso de polimerización. Ambos iniciadores de polimerización generan radicales libres, el persulfato de amonio espontáneamente en solución (enlace peróxido), y la riboflavina mediante fotodescomposicion. .

Los límites prácticos de pH para realizar PAGE están entre pH 3 y 10, ya que algunas reacciones hidrolíticas (como desaminación) ocurren a pHs extremos.

Las bandas pueden ser evidenciadas mediante diferentes métodos como tinción con colorantes, revelado “fotográfico”, autorradiografía ó con marcaje fluorescente. En la presente aplicación se usará marcaje con plata, método altamente sensible y rápido. Las bandas de proteína son fijadas en la posición final después de la electroforesis precipitando las proteínas con metanol y ácido acético, las bandas son sensibilizadas con tiosulfato de sodio, que mejora el contraste entre las bandas teñidas y el fondo del gel, posteriormente el gel se trata con nitrato de plata, los iones plata se complejan con la proteina, y en un paso posterior, similar al revelado fotográfico, los iones plata complejados sufren una reducción mucho mas rápida que los iones plata libres, formando partículas coloidales de plata en las dos superficies del gel, preferencialmente sobre las bandas de proteína, haciéndolas visibles. Los límites de detección son del orden de ng de proteina.

Electroforesis de proteínas del suero humano

Las proteínas presentes en el suero humano pueden agruparse en 4 fracciones dependiendo de su mobilidad electroforética: Albúminas, alpha, beta y gamma globulinas. La mayoría de las alpha y beta globulinas son sintetizadas en el hígado, mientras que las gamma globulinas son producidas por linfocitos y células plasmáticas.

MATERIALES Y EQUIPOS